Labor aktuell - MVZ Labor Münster

LABORAKTUELL
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Mikrobiomanalytik
Tabelle 2: Auswahl von Analysen zur Diagnose pathologischer Veränderungen im Verdauungstrakt
Maldigestion
Pankreas-Elastase 1 im Stuhl
Insgesamt hat die Untersuchung eine Sensitivität von ca. 95 % für die Diagnose der exokrinen
Pankreasinsuffizienz und erfasst gegenüber anderen Verfahren auch leichter die mittelschweren und
leichten Fälle.
Neues Zeitalter der Darmfloradiagnostik –
„Next Generation Sequencing“ (NGS) ermöglicht die
Analyse des komplexen Mikrobioms
Diagnostik und Verlaufskontrolle bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (Morbus Crohn,
Colitis ulcerosa), Abgrenzung Colon irritabile, Früherkennung des kolorectalen Karzinoms.
Albumin im Stuhl
Erhöhte Werte für Albumin im Stuhl werden bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen wie
Morbus Crohn oder Colitis ulcerosa gefunden. Im Schub kommt es aufgrund des Plasmaaustritts von
Albumin ins Darmlumen zu einer stärkeren Erhöhung.
Alpha-1-Antitrypsin im Stuhl
Die Bestimmung kann bei der Differenzierung von entzündlichen Darmerkrankungen (deutliche Er­
höhung) und Colon irritabile helfen. Dabei sprechen erhöhte Werte für entzündliche Prozesse im Darm.
Beta-Defensin
Die Beta-Defensine besitzen ein antimikrobielles Wirkungsspektrum gegenüber Pilzen (Candida) und
Bakterien.
EDN (Eosinophil-Derived
Neurotoxin)
EDN (Eosinophil-Derived Neurotoxin) ist ein von aktivierten eosinophilen Granolozyten sezerniertes
Glykoprotein mit antimikrobiellen Eigenschaften, das bei der Abwehr von Erregern beteiligt ist.
Erhöhte EDN-Spiegel im Stuhl geben einen Hinweis auf eine chronische intestinale Entzündung wie
Colitis ulcerosa und Morbus Crohn.
Laktoferrin im Stuhl
Laktoferrin ist in polymorphkernigen Granulozyten enthalten. Diese werden bei Entzündungen aktiviert
und setzen Laktoferrin frei. Erhöhte Konzentrationen von Laktoferrin im Stuhl werden daher bei ent­
zündlichen Darmerkrankungen gefunden.
Zonulin
Das Regulatorprotein Zonulin ist ein geeigneter Marker, um die Durchlässigkeit der Darmschleimhaut
zu messen. Die Zonulin-Bestimmung eignet sich zur Abklärung eines Leaky-Gut-Syndroms bei:
allergischen Erkrankungen, Autoimmunerkrankungen, Abdominalerkrankungen, multipler Sklerose
und Zöliakie.
Klinischer Hintergrund
Der menschliche Körper wird auf seiner gesamten
Oberfläche durch eine Vielzahl von Mikroorganis­
men besiedelt. Jeder Teil dieser sowohl äußeren als
auch inneren Oberflächen weist eine für die jeweilige
Körper­
lokalisation typische Zusammensetzung an
Mikro­organismen auf. Die Gesamtheit dieser Mikro­
organismen wird als Mikrobiota bezeichnet, der Nach­
weis der entsprechenden Geninformation als Mikro­
biom.
Darmflora beim Gesunden
Besonders im Darm findet sich eine Vielfalt an ver­
schiedenen Bakterien, Pilzen und anderen Mikroorga­
nismen mit bis zu 1.000 verschiedenen Spezies.
Immunparameter
sIgA im Stuhl
Das sekretorische IgA wird unabhängig vom Serum-IgA gebildet; ein Mangel kann daher auch bei
unauffälligem Serum-IgA-Spiegel auftreten und kommt vor bei: rezidivierenden Schleimhautinfekten,
Atopie und Autoimmunerkrankungen.
Während die Besiedlung im oberen Dünndarm beim
gesunden Menschen gering ist (< 105 Keime/g Darm­­inhalt), finden sich im Enddarm ca. 1011 Mikro­orga­
nismen/g Stuhl. Viele dieser Mikroorganismen ent­
wickeln eine enge Symbiose mit dem Wirtsorganismus.
Zum einen bietet der Wirtsorganismus optimalen
Schutz und optimale Wachstumsbedingungen für
viele Mikro­
organismen, zum anderen unterstützen
diese den Wirt in vielerlei Art und Weise, z. B. durch
die Bereitstellung von Vitaminen und anderen Nähr­
stoffen aus schwer verdaulichen Nahrungsbestand­
teilen, durch die Stimulation des Immunsystems und
durch Schutz vor der Invasion von Pathogenen. All das
unterstützt die Fitness des Wirtsorganismus.
Tumorscreening
Hämoglobin-HaptoglobinKomplex im Stuhl
Mit dem immunologischen Nachweis von humanem Hämoglobin bzw. Hämoglobin-HaptoglobinKomplex im Stuhl kann die Sensitivität und Spezifität der Screeningdiagnostik für das kolorektale
Karzinom deutlich gegenüber herkömmlichen Stuhltests verbessert werden.
Autoren:
Dr. med. Konrad Bode, Dr. med. Anne-Marie Fahr, Dr. med Michael
Weizenegger, Dr. Anke Veldenzer, Dr. Herbert Hof; Limbach Gruppe
Literatur:
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12. Swidsinski A: Standards for bacterial identification by fluorescence In
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Stand: Juni / 2016
Ihr Ansprechpartner:
Abteilung Mikrobiologie
E-Mail: [email protected]
Telefon: +49 251 60 91 60
MVZ Labor Münster GbR
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Herausgeber: © Limbach Gruppe SE – 06/2016_V1
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Entzündungsparameter/Malabsorption
Calprotectin im Stuhl
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Das Wichtigste auf einen Blick
■Neuere Daten zeigen die essenzielle
Bedeutung einer ausgewogenen mikrobiellen
Besiedlung des Darmes.
■Verschiebungen in der Zusammensetzung der
intestinalen Mikrobiota können zu vielfältigen
Gesundheitsstörungen führen.
■ Mikrobiomanalytik durch „Next Generation
Sequencing“ (NGS) ermöglicht die Analyse der
Gesamtheit der Mikroorganismen eines kom­
plexen Mikrobioms.
Gleichzeitig aber muss sich der Wirtsorganismus vor
der Penetration der potenziell pathogenen Mikro­
organismen in die Mukosa schützen. Dies erfolgt durch
den Aufbau einer Schutzbarriere bestehend aus der
Schleimhaut (Epithel, Submukosa mit Phagozyten und
T-Zellen), der Sekretion antimikrobieller Substanzen
(z. B. Defensine) und von Antikörpern. Auf der ande­
ren Seite ist die Steuerung der Zusammensetzung der
mikrobiellen Besiedlung durch den Wirt, aber auch
durch die gegenseitige Beeinflussung der Mikroorga­
nismen von entscheidender Bedeutung zur Vorbeu­
gung eines Eindringens von Pathogenen in den Körper.
Jeder gesunde Erwachsene hat eine singuläre, über
die Zeit relativ stabile Mikrobiota. Trotz extremer
inter­
individueller Unterschiede gibt es einige kon­
servierte Anteile, die eine ausbalancierte Mikrobiota
charakterisieren. Auffallend ist die Dominanz von ob­
ligat anaeroben Bakterien, die zu der phylogenetischen
Abteilung der Bacteroidetes (z. B. Bacteroidaceae und
Prevotellaceae) und Firmicutes (z. B. Clostridien, Rumi­
nokokken und Eubacteriaceae) gehören (Tabelle 1).
Actinobacteria, Proteobacteria (wie z. B. Enterobac­
teriaceae) und Fusobacteria hingegen, können zwar
in einer ausgeglichenen Mikrobiota nachgewiesen
werden, sind quantitativ aber von untergeordneter
Bedeutung.
Allgemein gilt eine hohe Diversität der Mikrobiota, das
heißt das Vorliegen einer besonders großen Vielfalt
an Mikroorganismen, als Zeichen einer gesunden
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Darmbesiedlung. Auch erhöhtes Vorkommen einzelner
„besonderer“ Bakterienspezies, wie z. B. Faecalibacte­
rium prausnitzii, korreliert mit einer gesunden Darm­
flora.
Fehlbesiedlung (Dysbakterie) und ihre Folgen
Eine Abnahme physiologisch wichtiger Mikroorganis­
men oder der physiologischen Diversität sowie eine
Zunahme von potenziell pathogenen Bakterien kann
zu einer Fehlbesiedlung führen (Dysbakterie).
Dysbakterie wird häufig charakterisiert durch die Zu­
nahme von Bakterien, die nicht zur Klasse der Bacte­
roidia oder Clostridia gehören. Eine der häufigsten
Auffälligkeiten einer solchen Dysbakterie ist die Zu­
nahme von fakultativ anaeroben Enterobacteriaceae.
In neueren Untersuchungen wurde nachgewiesen,
dass abhängig vom Grad einer solchen Dysbakte­
rie vielfältige Gesundheitsstörungen auftreten oder
ungünstig beeinflusst werden können. Hierzu zählt
unter anderem eine Förderung des Risikos einer
Adipositas und ihrer Folgeerkrankungen, wie Diabetes
und Arteriosklerose.
Auch bei chronisch entzündlichen Darmerkrankungen
wird einer Dysbakterie eine pathogenetisch relevante
Rolle zugesprochen. In verschiedenen experimentellen
Tiermodellen entzündlicher Darmerkrankungen fiel
eine Dysbakterie mit stark erhöhter Zahl der Entero­
bacteriaceae auf. In Übereinstimmung mit diesem
experimentellen Befund fand sich auch bei Patienten,
die an Morbus Crohn erkrankt sind, eine Erhöhung der
Zahl der Enterobacteriaceae. Außer der Zunahme von
Enterobacteriaceae wird bei Patienten mit entzünd­
lichen Darmerkrankungen eine Verminderung von
F. prausnitzii beschrieben. Eine starke Verminderung
von F. prausnitzii bei Patienten mit Morbus Crohn
scheint mit einer erhöhten Rezidiv-Häufigkeit der Er­
krankung assoziiert zu sein. Auch bei malignen Erkran­
kungen des Darmes werden Veränderungen in der
Zusammensetzung der Darmflora beobachtet. Diese
Veränderungen scheinen so deutlich zu sein, dass ein
Tabelle 1: Wichtige Bestandteile des humanen intestinalen Mikrobioms
Phylum
Klasse/Familie
Genus/Spezies
Bacteroidetes
Bacteroidia
Bacteroides spp.*
Firmicutes
Clostridia
Prevotella spp.*
Clostridium spp.*
Faecalibacterium spp.
Ruminococcus spp.
Roseburia spp.
Butyrivibrio fibrisolvens
Lachnospira multipara
Eubacterium rectale
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Peptostreptococcus spp.
Veilonella spp.
Lactobacillus spp.
Bacilli
Enterococcus spp.
Streptococcus spp.
Staphylococcus spp.
Proteobacteria
Alphaproteobacteria
Burkholderia spp.
Betaproteobacteria
Gammaproteobacteria
Enterobacteriaceae
Escherichia coli
Proteus spp.
Klebsiella spp.
Pseudomonadaceae
Actinobacteria
Pseudomonas spp.
Bifidobacterium spp.*
Collinsella
Fusobacteria
Fusobacterium spp.
Verrucomicrobia
Akkermansia muciniphila
Bakterien, die üblicherweise in der klassischen kulturellen Stuhldiagnostik nachgewiesen werden können, sind unterstrichen.
* Kultureller Nachweis nur für einige Spezies möglich.
diagnostischer Nutzen einer quantitativen Analyse der
intestinalen Mikrobiota zur Früherkennung des kolo­
rektalen Karzinoms diskutiert wird.
Seit langer Zeit ist bekannt, dass Antibiotikatherapie
durch Zerstörung der physiologischen Mikrobiota zu
latenten und auch klinisch manifesten Entzündungen
der Darmschleimhaut führen kann. Neben den diäteti­
schen und gastroenterologischen Störungen scheinen
sogar neurologische Erkrankungen mit Veränderun­
gen in der Intestinalbesiedlung einherzugehen. Einige
Veröffentlichungen legen einen Zusammenhang
zwischen Autismus und intestinaler bakterieller Fehl­
besiedlung nahe.
Indikation
Die Methode eignet sich zur Bestimmung der Zu­
sammensetzung des intestinalen Mikrobioms. Eine
Verschiebung der intestinalen Flora ergibt z. B. einen
Hinweis auf Erkrankungen des Darmtraktes oder auf
verschiedene Stoffwechselerkrankungen.
Diagnostik der Dysbakterie
In der etablierten klassischen kulturellen Stuhl­
diagnostik werden die Bakterien auf einer Vielzahl
verschiedener Nährmedien unter aeroben und an­
aeroben Bedingungen angezüchtet und quantitativ
beurteilt. Es liegen eingehende Erfahrungen darüber
vor, in welcher Weise qualitative und/oder quantita­
tive Änderungen, die bei der Anzucht von Bakterien
und Pilzen gefunden werden, auf pathologische Ver­
änderungen rückschließen lassen. Es muss aber be­
rücksichtigt werden, dass mit dem kultivierbaren Teil
der Mikrobiota nur der Nachweis eines Teils (40 %,
Tabelle 1) der Mikroorganismen der intestinalen Flora
möglich ist.
Besonders die quantitativ dominierenden obligat
anaerob wachsenden Bakterien lassen sich nur zum
Teil anzüchten. Der Nachweis dieser Keime erfordert
moderne molekularbiologische Verfahren. Hier ste­
hen vor allem Methoden wie die Polymerase-Ketten­
reaktion (PCR) oder DNA-Hybridisierungsverfahren zur
Verfügung. Bei diesen Methoden werden spezies­
spezifische Unterschiede in der Geninformation ge­
nutzt, um die verschiedenen Mikroorganismen zu
identifizieren und zu quantifizieren.
Da bei diesen Methoden nicht mehr die lebenden
Mikroorganismen nachgewiesen werden, sondern
ihre Geninformation, ist man dazu übergegangen,
nicht mehr von „Mikrobiota“, sondern vom „Mikro­
biom“ zu sprechen. Ein Nachteil dieser Methode ist,
dass nur gezielt nach einzelnen Mikroorganismen un­
tersucht werden kann. Mit der PCR beziehungsweise
dem DNA-Hybridisierungsverfahren ist es möglich,
Befundmitteilung Mikrobiom
■ Der Befund beinhaltet eine tabellarische
Darstellung der 30 häufigsten Bakterien sowie
einiger wichtiger Indexkeime.
■Der Enterotype
■Die α-Diversität, das heißt die quantitative
Angabe, wie viele verschiedene Bakterien­
arten in der Probe detektiert werden.
■Die β-Diversität, das heißt ein Vergleich
des Mikrobioms der Probe mit einem
gesunden Kontrollkollektiv, das bezüglich
Alter, Geschlecht und Ernährungszustand
vergleichbar ist.
■Auf Wunsch werden die Daten der gesamten
Analyse zur Verfügung gestellt.
■Die Ergebnisse der Mikrobiomanalyse bilden
einen Istzustand der Darmflora ab. Die Daten
können nur im Zusammenhang mit dem klini­
schen Bild interpretiert werden. Eine Diagnose
oder eine Therapieempfehlung kann daher
nicht vom Labor erfolgen.
auf wichtige Mikroorganismen zu screenen. Die Ge­
samtheit des Mikrobioms lässt sich jedoch mit dieser
Methode nicht erfassen.
Der Durchbruch in der Mikrobiomanalytik erfolgte in
den letzten Jahren durch die Weiterentwicklung des
sogenannten „Next Generation Sequencing“ (NGS).
Beim NGS handelt es sich um eine Sequenzier­
methode, bei der Millionen von kurzen DNA-Fragmen­
ten parallel analysiert werden. Die einzelnen Sequenz­
abschnitte werden verwendet, um die verschiedenen
Mikro­organismen zu identifizieren. Über die Häufig­
keit, mit der bestimmte Sequenzen gefunden werden,
ist eine Quantifizierung der verschiedenen Mikro­
organismen möglich. Durch Einsatz dieser Methode
kann innerhalb kürzester Zeit die Zusammensetzung
der Gesamtheit der Bakterien oder der Pilze eines
komplexen Mikrobioms analysiert werden.
Ergänzend zur Mikrobiomanalytik bzw. klassischen
kulturellen Dysbakteriediagnostik eignet sich die Ana­
lyse einiger zusätzlicher Parameter, um pathologische
Veränderungen im Verdauungstrakt zu diagnostizieren
(Tabelle 2).